Does Late Maturity Alpha-Amylase Impact Wheat Baking Quality?
Marcus Newberry1Alexander B. Zwart2Alex Whan1Jos C. Mieog1,2†May Sun1Emmett Leyne1Jenifer Pritchard1Sergio Nicolas Daneri-Castro1Kutty Ibrahim1Dean Diepeveen3Crispin A. Howitt1Jean-Philippe F. Ral1*
1Agriculture and Food, Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation, Canberra, ACT, Australia
2Data61, Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation, Canberra, ACT, Australia
3Department of Primary Industries and Regional Development, South Perth, WA, Australia
Late maturity α-amylase (LMA) and pre-harvest sprouting (PHS) are both recognized as environmentally induced grain quality defects resulting from abnormally high levels of α-amylase. LMA is a more recently identified quality issue that is now receiving increasing attention worldwide and whose prevalence is now seen as impeding the development of superior quality wheat varieties. LMA is a genetic defect present in specific wheat genotypes and is characterized by elevated levels of the high pI TaAMY1 α-amylase, triggered by environmental stress during wheat grain development. TaAMY1 remains present in the aleurone through the harvest, lowering Falling Number (FN) at receival, causing a down-grading of the grain, often to feed grade, thus reducing the farmers’ income. This downgrading is based on the assumption within the grain industry that, as for PHS, a low FN represents poor quality grain. Consequently any wheat line possessing low FN or high α-amylase levels is automatically considered a poor bread wheat despite there being no published evidence to date, to show that LMA is detrimental to end product quality. To evaluate the validity of this assumption a comprehensive evaluation of baking properties was performed from LMA prone lines using a subset of tall non-Rht lines from a multi-parent advanced generation inter-cross (MAGIC) wheat population grown at three different sites. LMA levels were determined along with quality parameters including end product functionality such as oven spring, bread loaf volume and weight, slice area and brightness, gas cell number and crumb firmness. No consistent or significant phenotypic correlation was found between LMA related FN and any of the quality traits. This manuscript provides for the first time, compelling evidence that LMA has limited impact on bread baking end product functionality.
Introduction
Alpha-amylases (EC 3.2.1.1) are endohydrolases that cleave α-1,4 glucosidic bonds breaking down starch macromolecules into smaller polysaccharides. Many biological and industrial processes, such as mammalian digestion, plant metabolism, biofuel production, baking, fermentation, and malting rely on the hydrolysis of native starch by α-amylase (Janecek et al., 2014).
Alpha-amylase is considered to be one of the primary enzymes responsible for starch degradation in cereals and particularly wheat. During grain germination, α-amylase initiates the conversion of starch into simple sugars to fuel embryo and coleoptile growth in the first few days of germination. At least four α-amylase isoforms have been described in wheat grain but only a subset of specific isoforms are involved either in grain development or in the germination process (Mieog et al., 2017).
Alpha-amylase has been consistently used by the baking industry to improve dough properties and end product quality (He and Hoseney, 1991). Several studies have demonstrated the beneficial effect of α-amylase on bread texture and elasticity (Patel et al., 2012; Barrera et al., 2016). However, detection of elevated levels of endogenous α-amylase in the grain has been considered as a serious grain quality defect due to its presumed effect on end-product quality (Buchanan and Nicholas, 1980). Premature production of α-amylase during grain development is the result of two different conditions that are considered quality defects by the wheat industry: (1) PHS and (2) LMA. Although PHS is considered an important issue by both wheat breeders and growers globally, it is only in Australia and the United Kingdom over several decades that LMA has been regarded as a significant grain quality defect, although more recently LMA has been considered an issue in other countries (for review Mares and Mrva, 2014).
Pre-harvest sprouting is a genetic condition that breaks grain dormancy when environmental triggers prior to harvest (usually heavy rainfall) cause the grain to germinate while still on the head (Gubler et al., 2005). Sprouted grain is unacceptable as milling wheat leading to it being downgraded to animal feed quality with a resulting decrease in value. Domestication and modern conventional breeding aims to reduce grain dormancy by encouraging rapid and uniform plant establishment, however, this has inadvertently favored PHS susceptibility and occurrence. Thus developing PHS resistance has become a high priority for breeders (Martinez et al., 2018).
Late maturity alpha-amylase is a genetic defect present in specific wheat genotypes and is characterized by abnormally elevated levels of a single α-amylase (TaAMY1) isoform in the aleurone layer during grain development through to harvest (Mares and Mrva, 2008). A recent study has also highlighted the potential involvement of TaAMY4 in the LMA phenotype (Mieog et al., 2017). This accumulation of α-amylase has no detrimental effect on grain composition, morphology, dormancy, or germination. Since the Green Revolution, which enhanced yield and reduced the height of wheat plants through the introduction of the semi-dwarf genes (Rht-D1), LMA has become a stochastically induced genetic defect triggered by environmental conditions (Gooding et al., 2012; Mieog et al., 2017). In Australia, a cold shock at a specific developmental stage induces LMA, while studies in the United Kingdom have described a similar phenotype following a heat shock (Farrell and Kettlewell, 2008).
Elevated levels of α-amylase in the grain reduce the value produced by the FN test. The FN test was developed by Hagberg (1960) as a rapid, high throughput method for determining α-amylase activity in grain and later adopted by industry as a test for sprout-damaged grain (Best and Muller, 1991). In Australia, if low FN is detected, there is a potential $AUS20–50/t penalty to growers due to downgrading superior milling wheat classes to feed grade (Kingwell and Carter, 2017). Therefore the premature production of α-amylase during grain development known as LMA has been considered the major quality problem affecting both growers and breeders in the Australian wheat industry (Lunn et al., 2001; Mares and Mrva, 2014). In the past few years the United States and France have encountered elevated α-amylase levels at harvest without signs of sprouting or starch damage, which suggests that LMA prone lines are present in all breeding programs worldwide. In the United States, the Pacific North West was severely impacted during the 2016 harvest, with losses estimated to be in the order of $US140 million (Bettge, 2018).
Despite the increasing importance and negative economic impacts of LMA to grain growers, to date only one study has been conducted to understand the mechanism underlying expression of LMA (Barrero et al., 2013). Unlike PHS with its widely acknowledged and clearly demonstrated detrimental effects on end-use quality, there is no direct evidence that elevated levels of α-amylase have negative effects on end-use quality (Ral et al., 2016, 2018b).
The current strategies to mitigate, and if possible eliminate LMA revolve around efforts to understand the genetic basis of LMA (Mrva and Mares, 2001; Mohler et al., 2014; Mieog et al., 2017; Milczarski et al., 2017; Borner et al., 2018). These LMA strategies have been put in place despite a clear knowledge gap around the real impact of LMA on wheat flour end product quality. One of the key issues that has impeded developing an understanding of the impact of LMA on end product quality has been the difficulty in inducing LMA under controlled conditions, on a scale large enough to produce sufficient grain for baking studies. The stochastic nature of LMA expression (combination of genetic, environmental conditions and plant developmental stage) makes the prediction of LMA occurence very cumbersome during LMA dedicated field trial (Mares and Mrva, 2014). To overcome this limitation we apply a novel approach focussed on the phenotypic aspects of LMA via exclusively studying the less economically significant constitutive LMA expressing non-Rht tall lines to assess the impact of LMA related elevated α-amylase on baking quality (Gooding et al., 2012).
This study involves a comprehensive assessment of LMA prone lines using a subset of LMA constitutive expressers from a MAGIC wheat population (Huang et al., 2012). LMA expression levels, FN test, total α-amylase activity and a LMA-specific antibody test available in Australia were determined, along with quality parameters including end product functionality such as bread loaf volume, bread slice gas cell number, size, and structure.
This study provides the first direct evaluation as to whether elevated levels of α-amylase caused by LMA impact baking quality."
https://www.frontiersin.orghttps//www.frontiersin.org/journals/plant-science/articles/10.3389/fpls.2018.01356/full#:~:text=Frontiers%20in%20Plant,impact%20baking%20quality.
هل إنزيم الألفا أميليز المتأخر النضج (LMA) وإنبات الحبوب قبل الحصاد (PHS) يؤثران فعلاً على جودة الخبز؟
يُعترف بأن كل من إنزيم الألفا أميليز المتأخر النضج (LMA) وإنبات الحبوب قبل الحصاد (PHS) من العيوب التي تؤثر على جودة الحبوب نتيجة ظروف بيئية تؤدي إلى ارتفاع غير طبيعي في مستويات إنزيم الألفا أميليز. ويُعتبر LMA مشكلة جودة تم التعرف عليها مؤخرًا نسبيًا وأصبحت الآن محط اهتمام عالمي متزايد، حيث يُنظر إلى انتشاره على أنه عائق أمام تطوير أصناف قمح ذات جودة عالية.
الـ LMA هو خلل جيني موجود في أنماط وراثية معينة من القمح، ويتميّز بارتفاع مستويات إنزيم α-amylase من النوع TaAMY1 ذي الأس الهيدروجيني المرتفع (pI)، ويُحفّز نتيجة للضغط البيئي خلال مرحلة تطور الحبة. يبقى هذا الإنزيم موجودًا في طبقة الألورون حتى الحصاد، مما يؤدي إلى انخفاض رقم السقوط (FN) عند الاستلام، وبالتالي إلى خفض تصنيف الحبوب غالبًا إلى صنف علفي، مما يقلل من دخل المزارعين. هذا التخفيض في التصنيف مبني على افتراض شائع في صناعة الحبوب بأن انخفاض FN، كما هو الحال مع PHS، يدل على جودة ضعيفة للحبوب. ونتيجة لذلك، يتم اعتبار أي صنف قمح منخفض FN أو عالي الألفا أميليز تلقائيًا غير صالح لصناعة الخبز، على الرغم من عدم وجود أدلة منشورة حتى الآن تثبت أن LMA يؤثر سلبًا على جودة المنتج النهائي.
لاختبار صحة هذا الافتراض، تم إجراء تقييم شامل لخصائص الخبز باستخدام سلالات عرضة لـ LMA من مجموعة سلالات قمح متعددة الأصول (MAGIC) نمت في ثلاثة مواقع مختلفة. وقد تم قياس مستويات LMA إلى جانب معايير الجودة، بما في ذلك خصائص المنتج النهائي مثل ارتفاع الرغيف، حجم ووزن رغيف الخبز، مساحة ودرجة سطوع الشريحة، عدد خلايا الغاز، وصلابة اللب. ولم يُلاحظ وجود ارتباط ثابت أو ذي دلالة إحصائية بين انخفاض FN المرتبط بـ LMA وأي من صفات الجودة.
مقدمة
إنزيمات الألفا أميليز (EC 3.2.1.1) هي إنزيمات هيدرولازية تقوم بتكسير الروابط α-1,4 الغلوكوزيدية، مما يؤدي إلى تفكيك جزيئات النشا الكبيرة إلى سكريات أصغر. وتعتمد العديد من العمليات البيولوجية والصناعية، مثل الهضم لدى الثدييات، واستقلاب النبات، وإنتاج الوقود الحيوي، والخبز، والتخمير، والتعتيق، على التحلل المائي للنشا بواسطة الألفا أميليز.
ويُعتبر إنزيم الألفا أميليز من الإنزيمات الأساسية المسؤولة عن تكسير النشا في الحبوب وخاصة القمح. وخلال إنبات الحبوب، يبدأ الألفا أميليز في تحويل النشا إلى سكريات بسيطة لتغذية نمو الجنين والقمْع في الأيام الأولى للإنبات. وقد تم تحديد أربعة أشكال مختلفة من هذا الإنزيم في حبوب القمح، ولكن فقط بعض هذه الأشكال تشارك إما في تطوير الحبة أو في عملية الإنبات.
وقد تم استخدام الألفا أميليز باستمرار من قبل صناعة الخبز لتحسين خصائص العجين وجودة المنتج النهائي، حيث أظهرت العديد من الدراسات فائدته في تحسين ملمس الخبز ومرونته. ومع ذلك، فإن اكتشاف ارتفاع مستويات الألفا أميليز الداخلي في الحبوب كان يُعتبر عيبًا خطيرًا في الجودة، نتيجةً لتأثيره المفترض على جودة المنتج النهائي. وينتج الإنتاج المبكر للألفا أميليز أثناء تطوير الحبة عن حالتين تُعتبران عيوبًا في الجودة من قبل صناعة القمح: (1) PHS و(2) LMA.
رغم أن إنبات الحبوب قبل الحصاد يُعد مشكلة مهمة على مستوى عالمي، إلا أن LMA اعتُبر عيبًا خطيرًا في جودة الحبوب بشكل رئيسي في أستراليا والمملكة المتحدة لعقود، وقد بدأ يُعتبر مؤخرًا مشكلة أيضًا في دول أخرى.
الـ PHS هو حالة وراثية تكسر فيها البيئة المحيطة قبل الحصاد (عادةً الأمطار الغزيرة) سكون الحبة فتبدأ في الإنبات وهي لا تزال على السنبلة. وهذا يجعل الحبة غير صالحة للطحن، مما يؤدي إلى خفض تصنيفها إلى صنف علفي وفقدان في القيمة. وقد أدت التربية الحديثة والانتخاب إلى تقليل السكون الوراثي لتحفيز سرعة الإنبات والتجانس، مما زاد من القابلية للإصابة بـ PHS، وأصبح تطوير مقاومة PHS أولوية عالية للمربين.
أما الـ LMA، فهو خلل جيني يؤدي إلى ارتفاع مستويات نوع واحد من الألفا أميليز (TaAMY1) في طبقة الألورون خلال نمو الحبة وحتى الحصاد. وأشارت دراسة حديثة أيضًا إلى إمكانية تورط TaAMY4 في هذا النمط. ويجدر بالذكر أن هذا التراكم للإنزيم لا يؤثر على تركيب الحبة أو شكلها أو سكونها أو قدرتها على الإنبات.
منذ الثورة الخضراء، التي حسنت الغلة وقللت من طول نبات القمح من خلال إدخال جينات القصر (Rht-D1)، أصبح LMA خللًا جينيًا يُحفّز عشوائيًا بفعل البيئة. ففي أستراليا، تؤدي موجة برد في مرحلة معينة من تطور الحبة إلى ظهور LMA، بينما أظهرت الدراسات في المملكة المتحدة نفس التأثير بعد موجة حرارة.
تؤدي المستويات المرتفعة من الألفا أميليز إلى خفض رقم السقوط (FN)، وهو اختبار طوره "هاغبرغ" عام 1960 لقياس نشاط الألفا أميليز في الحبوب بسرعة وكفاءة، وتم اعتماده لاحقًا من قبل الصناعة لاختبار تلف الإنبات. وفي أستراليا، يؤدي انخفاض FN إلى فرض غرامات تصل إلى 20–50 دولارًا أستراليًا للطن على المزارعين نتيجة خفض تصنيف القمح من فئة الطحن الممتاز إلى فئة العلف. ولذلك، فإن الإنتاج المبكر لإنزيم الألفا أميليز نتيجة LMA يُعتبر من أخطر مشكلات الجودة التي تؤثر على المزارعين والمربين في صناعة القمح الأسترالية. وفي السنوات الأخيرة، سجلت الولايات المتحدة وفرنسا مستويات مرتفعة من الإنزيم أثناء الحصاد دون وجود علامات على الإنبات أو تلف النشا، مما يشير إلى وجود LMA في برامج التربية العالمية. وقد تأثرت منطقة شمال غرب المحيط الهادئ الأمريكية بشدة في موسم حصاد 2016، بخسائر قُدّرت بحوالي 140 مليون دولار أمريكي.
ورغم الأهمية المتزايدة والتأثيرات الاقتصادية السلبية لـ LMA، لم تُجرَ سوى دراسة واحدة لفهم آلية التعبير عن هذا الخلل. وعلى عكس PHS، الذي ثبت ضرره على جودة المنتج النهائي، لا يوجد دليل مباشر يثبت أن ارتفاع مستويات α-amylase يؤثر سلبًا على جودة المنتج النهائي.
الاستراتيجيات الحالية لمواجهة LMA تعتمد على فهم الأساس الجيني له، رغم وجود فجوة معرفية واضحة حول تأثيره الفعلي على جودة الدقيق. ومن التحديات التي أعاقت دراسة تأثير LMA هو صعوبة تحفيزه في ظروف خاضعة للسيطرة على نطاق واسع لإنتاج كمية كافية من الحبوب للدراسات التجريبية. وتعقّد طبيعة LMA، الناتجة عن تفاعل الجينات والبيئة ومرحلة تطور النبات، تجعل من التنبؤ بحدوثه في التجارب الميدانية أمرًا صعبًا. ولتجاوز هذا التحدي، اعتمد الباحثون نهجًا جديدًا يركز على الصفات الظاهرية لـ LMA من خلال دراسة خطوط طويلة غير مقزمة تعبر عن LMA بشكل مستمر.
تتضمن هذه الدراسة تقييمًا شاملًا لخطوط معرضة لـ LMA باستخدام مجموعة فرعية من خطوط قمح MAGIC. وتم قياس مستويات التعبير عن LMA، واختبار FN، والنشاط الكلي لإنزيم الألفا أميليز، واختبار الأجسام المضادة الخاص بـ LMA المتوفر في أستراليا، إلى جانب معايير الجودة بما في ذلك خصائص المنتج النهائي مثل حجم رغيف الخبز وعدد وحجم وتركيب خلايا الغاز في الشريحة.
تُعد هذه الدراسة أول تقييم مباشر يُجيب على سؤال: هل تؤثر المستويات المرتفعة من α-amylase الناتجة عن LMA على جودة الخبز؟
والنتيجة كانت: لا، التأثير ضئيل أو غير موجود على الإطلاق.
